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不經(jīng)顯微操作進行體細胞克隆(徒手克隆)
日期：2025-05-07 02:12
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摘要：
本文描述了一種手工平分無透明帶卵母細胞的改進核移植方法，Hoechst染色挑選胞質體，以培養(yǎng)的原代顆粒細胞為體細胞與2個胞質體進行2次細胞融合。檢測微滴、穴中穴(WOW)和微管(GO)3個系統(tǒng)培養(yǎng)的無透明帶胚胎，胚泡率分別為0，18和36 ，方法簡單、快速、經(jīng)濟，有可能取代現(xiàn)有的體細胞核移植技術而大量應用。
影響反芻動物體細胞核移植廣泛應用的主要技術障礙是：① 體外法效率低；②妊娠和產(chǎn)犢率低，出生后死亡及異常發(fā)育率高；③體外法所需實驗室設備費用高，技術難度大。顯微操作被認為是該工作中不可缺少的。此外，工具制作設備如研磨機，微鍛爐等的使用均需較高技術水平。這些要求相當程
度地限制了核移植技術的簡化及廣泛應用。
Peura等(1998)建立了一種不經(jīng)顯微操作進行牛胚胎細胞克隆的方法，用20~60細胞階段的卵裂球胚胎為供體。
用1016個卵母細胞進行了7次重復核移植試驗，其主要步驟的平均效率和大概需要的時間見表1。棄去**極體不明顯的卵母細胞(占28%)。這些丟棄的細胞不能用于核移植，因此，沒有將其列入效率統(tǒng)計。在該過程完成后5rain觀察到丟棄細胞在均分期間發(fā)生分解。*終胞質體選擇的準確度接近100％，盡管有9%的差別，這主要是因技術失誤及細胞估計數(shù)和實際獲得細胞數(shù)量間的差異而引起。細胞的丟棄幾乎都是在融合時因分解或技術失誤而引起。融合失敗(融合后15~20rain分離細胞對)的細胞對異常且在重復融合中通常被消除。
每個試驗平均用了105個卵母細胞并形成35個胞質體一胞質體一顆粒細胞3聯(lián)體。每次試驗時間不超過3h。分別在3個培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，其胚胎發(fā)育率見表2。除培養(yǎng)在微滴與WOW培養(yǎng)系統(tǒng)中胚胎卵裂率(2個或2個以上細胞)外，其余數(shù)值都差異顯著。一般來說，微滴中培養(yǎng)的胚胎沒有超過8~16細胞階段；僅在WOW或GO系統(tǒng)中能發(fā)育到致密期。通常在胚胎重組后第6 d開始形成胚泡，到第7d結束。因滋養(yǎng)層細胞將30％左右的胚胎粘在培養(yǎng)皿表面，因此在wOw系統(tǒng)中移去胚泡有些困難。但GO系統(tǒng)可避免這些問題。
不需顯微操作體細胞核移植的利益和前景遠大。當前的成果包括降低裝備費用，簡化預備工作及實驗技術要求低。任何做過胚胎方面試驗和口吸管方面工作的人都能很快掌握。盡管用卵母細胞試驗的直接工作沒有顯著減少，但降低了這些工作的技術難度。此外，與早期的技術相比，預備工作如制作工具可以省略。然而，應該注意到產(chǎn)生三倍體需要較多的卵母細胞。無透明帶的胚胎可能有利于嵌合體的制作，克隆方法的簡化也將有利于核移植的自動化。在卵母細胞成熟期間，用于建立該方法的供
體細胞是貼壁的原代培養(yǎng)的顆粒細胞，這些細胞并不是都很適合做供體。隨著方法的進一步改進，可能能用不同器官組織的傳代細胞和血清饑餓培養(yǎng)的細胞。
總之，這種新穎、簡單的體細胞核移植方法的出現(xiàn)，將大大降低目前核移植對昂貴且操作技術難度大的顯微操作儀的依賴。本文報道的初步試驗結果表明，該方法在體細胞克隆技術方面的發(fā)展具有相當大的潛力，滿足農(nóng)業(yè)領域內克隆技術廣泛應用的需要。上述方法的可行性需要通過這些移植胚胎妊娠(目前正在獲取)和產(chǎn)出健康后代的數(shù)據(jù)來證實。)摘自《國外畜牧科技》
